十万个为什么

最近到一个医学论坛“丁香园”看了看，在内分泌专栏下，看到一个很火的关于胰岛分离培养与功能测试的帖子，很高兴看到国内开始越来越多地关注胰岛研究。我在胰岛领域已经工作近10年了，每天的工作就是胰岛，从分离培养开始，到做各种各样的实验，我每年大约要分离出10到25万个胰岛，所以很想谈谈自己的感受。

最早的胰岛分离技术见于1967年糖尿病杂志发表的Paul Lacy的文章，描述了如何从大鼠胰腺分离完整胰岛的技术，到现在半个世纪过去了，基本技术还是当年的。总的原理就是把胶原酶注射到老鼠胆管里，但要阻断胆管流入小肠胆胰壶腹（Ampulla of Vater）的通道，所以胶原酶就反流到胰腺导管里，胰外分泌腺被胶原酶消化破坏，胰岛就分离出来了。

我自己用的方法与Lacy的方法尽管原理类似，但还是有很大的不同。我是把Hanks缓冲液注射到胆管里，象吹气球一样用Buffer把胰腺吹起来，大鼠，小鼠都是这样，然后把胰腺剥离下来，放到一边等待消化，这样可以很从容地一只接一只地做，我最多的时候可以一次做10只小老鼠，三只大老鼠。这样做的好处就是可以大规模的分离胰岛，上午10只小鼠，下午10只，每天最多可以分离到5000到10000个小鼠胰岛。

分离下来的胰腺要进行“纯化”处理，剪掉脂肪淋巴结等非胰腺组织，然后放在小烧杯里剪碎，最后放在小瓶子里，加上胶原酶，放入搅拌子，在磁力搅拌器上搅拌。这一步是胰岛分离的关键，胰岛对消化的时间非常敏感，过度消化和消化不足之间的窗口很窄，消化时间又因老鼠不同，胶原酶不同而需要调整，这个需要经验与感觉，很难说出一定的规则来，但总的来说就是胰腺已经被消化掉，但又不能成为浆糊状。

最后用Hanks缓冲液洗去胶原酶，然后用Ficoll梯度离心，27%，23%，20.5%和11%的Ficoll，胰岛最后都聚集在11%和20.5%，以及20.5%与23%之间。要想得到纯度高的胰岛，还需要手工在解剖显微镜下拣选，方法是用一个外面涂成黑色的玻璃平皿，从侧边给光，这样即使不用显微镜也能清晰地看到白色发亮的胰岛。

最后放到培养箱里培养，用RPMI 1640培养基，10%FBS，加抗菌素，10 mM 葡萄糖。培养3天后，就可以测定胰岛功能了，还可以做很多事情。

文献：

Lacy P, Kostianovsky M (1967). “Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas”. Diabetes 16 (1): 35–39.

一个胰岛分离的视频，不是我自己用的方法。

http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=255

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